七月

今日で七月も終了か。なんかえらい早かったな、って、ついこないだ六月が終わった時にも書いた気がするけど。今月はほんま、ミネアポリスでのSDBがメインイベントやったなぁという感じ。ほいで、来月八月のメインイベントは末に札幌で開催されるCell Competitionの国際シンポジウム。このシンポジウムではこないだSDBで話したものとは違うテーマでトークをする予定やさかいに、これまたちょっとしっかり準備せなあきません。でもカレンダーを見ると、今のところ意外にも八月はそれ以外の予定はあんまり入ってないやん。盆休みとかあるけど、久しぶりにちょっと落ち着いてやれるかな。

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila

そういやJoVEのビデオのプルーフが来てからもう一ヶ月も経ってたのだけど、今日ようやくパブリッシュされましたという連絡が来た。ということで、ついにKの１本目の論文がビデオとともにJoVEでオンラインに登場。普段からショウジョウバエのイマジナルディスクを使ってクローン解析とかしている方々にとっては、実験技術的に目新しいことは別にないだろうと思うけど、tumor phenotypeを誘導して観察してそれに対する考察をする上で有用な情報は色々と含まれているはず。ということで、ご興味のある方はとりあえずビデオをお楽しみください。

Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia.  J. Vis. Exp. (125), e55901.
In the early stages of cancer, transformed mutant cells show cytological abnormalities, begin uncontrolled overgrowth, and progressively disrupt tissue organization.  Drosophila melanogaster has emerged as a popular experimental model system in cancer biology to study the genetic and cellular mechanisms of tumorigenesis.  In particular, genetic tools for Drosophila imaginal discs (developing epithelia in larvae) enable the creation of transformed pro-tumor cells within a normal epithelial tissue, a situation similar to the initial stages of human cancer.  A recent study of tumorigenesis in Drosophila wing imaginal discs, however, showed that tumor initiation depends on the tissue-intrinsic cytoarchitecture and the local microenvironment, suggesting that it is important to consider the region-specific susceptibility to tumorigenic stimuli in evaluating tumor phenotypes in imaginal discs.  To facilitate phenotypic analysis of tumor progression in imaginal discs, here we describe a protocol for genetic experiments using the GAL4-UAS system to induce neoplastic tumors in wing imaginal discs.  We further introduce a diagnosis method to classify the phenotypes of clonal lesions induced in imaginal epithelia, as a clear classification method to discriminate various stages of tumor progression (such as hyperplasia, dysplasia, or neoplasia) had not been described before.  These methods might be broadly applicable to the clonal analysis of tumor phenotypes in various organs in Drosophila.

Minneapolis stroll

今回のミネアポリス出張での写真を少し置いておこう。

Minneapolis Institute of Art
この美術館はなんだかとても落ち着いていて、コレクションも素晴らしかったし、本当に一日楽しむことができた。人が少なくてすごく空いているのも良いんだろう。しかもタダ。ここはまた来たい。

ミネアポリスのダウンタウン。学会会場の近辺はビジネス街なのか、なんだか人が少なくて変な感じだったけど、ミシシッピ川の方へ向かって歩いて行くと、もう少し活気のある街が現れた。

ビルの谷間でテニスの大会が行われていたり。

ミネソタ大学のN先生が車で連れて行ってくれた隣町、セントポールの大聖堂。この裏手からセントポールの街を見渡すことができた。

帰っても時差ぼけ

さて、一昨日の晩に無事三島に帰ってきました。そしてまた時差ぼけに苦しんでいるのだけども、出張中にもしっかりと実験を進めてくれているラボテクのお二人から色々と質問があったり、今日が締め切りの研究報告書を急いで書いたりして、ちと疲れた。そんな中、今回のSDBでのユーのトークを very much enjoy しました、というとても前向きな評価をしてくれているメールが届いた。もしかしたら今回みたいなこういうのが、何か新しい展開をもたらすのかも知れない。

delay

今ミネアポリスの空港で出発待ちなのだが、どうやら出発時間が３時間ほど遅れる見込み。３ヶ月ほど前にトランジットで５時間滞在したこの空港で、またもや５時間ほど過ごすことになってしまった。。。

mission complete

全てのミッション終了。明日の朝、帰路につきます。

SDB終了

SDBは昨日の夜のバンケットで全てのイベントが終了。十数年前、学生の時に参加した時も最終日の晩餐会が結構豪華だったことを思い出した。会場にたくさん用意された丸テーブルに着くと、次々と料理が運ばれて来て、前のステージではバンドが演奏して、バンドの演奏に合わせて次第にみんな踊り出して、という感じ。今回は知り合いが誰もいなかったので初日は心細かったけど、気付くといつの間にかこの４日間で随分たくさんの友達ができていた。昨晩もバンケットのあとさらに在米日本人の連中と近くのバーで遅くまで話していた。今回ミネアポリス開催ということもあって、地元のミネソタ大学から参加していた日本人の方々と知り合うことができたのだが、そのうちの一つのラボはFly Labということで、今日はラボ訪問にまで誘っていただいた。今回の出張は随分と知り合いが増えそうだ。

Minnehaha Falls

今回の学会は誰一人として友達がいなくて心細かったので、とりあえずポスターセッションで話せそうな人と話していたら、昨晩ようやく数人の在米日本人ポスドクの方々とお知り合いになることができた。今日はトークの後でそのうちの一人のラボメンバーに紛れて一緒にベトナム料理を食べに行った後、さらに観光も御一緒させてもらった。訪れたのは、ダウンタウンから車で１０分ほどのところにあるMinnehaha Fallsという大きな滝がある公園。それにしても昨日まで随分と涼しかったのに、今日からいきなりものすごい猛暑になった。

success

今日の朝のセッションでトークをしてきた。Kが送ってくれたラストミニッツの新しいデータを見ながら、昨日ホテルの部屋でかなり色々と悩んだ末に、やっぱり今回はcell competitionとかtissue repairという文脈でのCCHの話は一切入れないことにした。そもそもCCHのメカニズムを解明するための研究なのだから、CCHのことを話さないのも変なのだが、これを純粋にnormal developmentにおけるprecise pattern formation、coordinated organogenesisという話に昇華させることに成功したんじゃないだろうか。セッションが終わったあとで、わざわざ自分のところに話をしに来てくれた数人のPIの話ぶりからそういう手応えは感じた。我ながら、なかなかうまくまとまったエエトークやったんやないやろうかと思う。ということで、思い切ってこういう形にしてみたのは成功。いよいよ論文の形も見え始めてきた気がする。

SDBスタート

昨日の午後からついに学会が始まった。意外と出席者の人数はFly Meetingより少ないかな。ポスターもそれほど多くはないんだけど、ポスターセッションは１日目から夜の１１時まで。スケジュールを見ると、３日目まで毎晩夜１１時までポスターセッションがあるようだ。朝は毎朝８時半からだし、この学会かなり激しいね。昨晩は、時差ボケからくる眠気がひどかったので、ポスターは早々に切り上げてホテルに帰ってきて就寝。

arrived at Minneapolis

ミネアポリスに無事到着。飛行機は羽田からの直行便だったので、乗り換えがなくていつもより楽だったように感じるけど、機内でほとんど眠れなかったので今かなり眠たい。少しぶらぶらとホテルの周辺を歩いてみたけど、なんか、大都市のダウンタウンなのに随分歩いている人の数が少なくて変な感じ。治安が悪そうな感じはあまりしないんだけど、大都市なのに人が少ないと不安になるな。まぁいいや、とりあえず今日はもう寝よう。

Concurrent Session 4

ということで、Minneapolis で今週木曜日から始まる SDB 76th Annual Meeting。自分は３日目、土曜日朝の Concurrent Session 4 "Biophysical and Biomechanical Aspects of Development" でトークをする予定。タイトルは、「Mechanical stretch-induced cell cycle modification in epithelial morphogenesis」。
てゆうても、日本の人はどれくらい来てはるかな。

明日出発

今日もものすごい暑かったねぇ。なんかばたばたしてる間に出発がもう明日になってしまったけど、発表スライドがまだちゃんと出来ていない。。。まぁ発表は土曜日なので、仕上げは向こうでやればいいか。Kの新しいデータも間に合いそうなら送ってもらうことにした。ということで、三ヶ月ぶりのアメリカか。明日から一週間、ミネアポリスに滞在します。

last-minute

さて、ミネアポリスへの出発が明後日に迫ってきた。一週間ラボを離れることになるので、今日と明日で色々と準備しとかないと。発表用のスライドの準備もしないとあかんのやけど、いまKが頑張ってやっている実験のデータをラストミニッツで入れることができるかどうかというところ。 
依頼されていた論文のレビューは今日が締め切りということだったので、先ほどコメントを送信。週末にこの論文を読んでいたのだけど、これはちょっとひどかった。英語もひどいけど、そもそも論文の体をなしていない。こんなんわざわざレビュワーに回さんとエディターがリジェクトするべきやろうとも思うけど、一応ちゃんとコメントしておきました。

heat

この数日、もう真夏のような熱気。昨日の午後、近所の川で涼んでいるときに森の中から蝉の声も聞こえたような。

Hommage à Marie de Bourgogne

Louis Chavy Hommage à Marie de Bourgogne AOC Coteaux Bourguignons 2014

Valois-Bourgogne家のブルゴーニュ公国最後の君主、Marie de Bourgogneへのオマージュ、という名前のワイン。２５歳の若さで亡くなったマリーは絶世の美女だったそうな。ちなみに、Coteaux Bourguignonsというのは比較的新しいブルゴーニュのAOC。甘酸っぱい新鮮なイチゴのような、フルーティで飲みやすい。蒸し暑いこの季節、少し冷やして飲むとエエよね。美味い。千円ちょい。

Flip-Flop

A cell cycle-independent, conditional gene inactivation strategy for differentially tagging wild-type and mutant cells.  eLife 6: e26420. 
Here, we describe a novel method based on intronic MiMIC insertions described in Nagarkar-Jaiswal et al. (2015) to perform conditional gene inactivation in Drosophila.  Mosaic analysis in Drosophila cannot be easily performed in post-mitotic cells.  We, therefore, developed Flip-Flop, a flippase-dependent in vivo cassette-inversion method that marks wild-type cells with the endogenous EGFP-tagged protein, whereas mutant cells are marked with mCherry upon inversion.  We document the ease and usefulness of this strategy in differential tagging of wild-type and mutant cells in mosaics.  We use this approach to phenotypically characterize the loss of SNF4Aγ, encoding the γ subunit of the AMP Kinase complex.  The Flip-Flop method is efficient and reliable, and permits conditional gene inactivation based on both spatial and temporal cues, in a cell cycle-, and developmental stage-independent fashion, creating a platform for systematic screens of gene function in developing and adult flies with unprecedented detail. 

フリップフロップ、ていうとビーチサンダルなんだけど、これは新しいflippase-inducedのmosaic system。このFlip-Flop cassetteの構造は以下の通り。
This cassette contains two modules that are placed in opposite orientation: a protein-trap (PT) module and a gene-trap (GT) module.  The PT module carries a splice acceptor (SA), followed by an in-frame EGFP coding sequence, and a splice donor (SD).  The GT module similarly contains a SA, but is followed by the T2A peptide sequence, an mCherry coding sequence, stop codons in all three reading frames, and an SV40 polyA signal.  The PT and GT modules are placed in opposite orientations and are flanked by inverted pairs of canonical FRT and FRT14 sites, forming a flip-excision switch (FLEx). 

両端にattBが付いているので、Recombination-Mediated Cassette Exchangeを利用して目的の遺伝子のイントロンに乗っているMiMIC (Minos-Mediated Integration Cassette)と載せ換える。これがprotein-trap orientationで入れば、目的の遺伝子のタンパクがEGFPでタグ付けされる。で、これにhsFLPでcassette inversionを誘導すると、EGFPは逆向きになってしまうので発現が消え、その代わりにそれまで逆向きに載っていたT2A-mCherryが発現することになり、transcriptionはその後ろについているstop codon & polyA sequenceで終わる。truncated transcriptはT2A siteがtranslational skipを誘導するので、mCherryだけがtranslateされるという仕組み。つまり、wild-type cloneはEGFPで、mutant cloneはmCherryでマークされる。
まぁ色々と想像はふくらむんやけど、やっぱりmitotic recombinationを利用するFLP-FRTと違って、post-mitotic cellsでもワークするというとこかね。

Affirmer

Affimer proteins are versatile and renewable affinity reagents.  eLife 6: e24903. 
Molecular recognition reagents are key tools for understanding biological processes and are used universally by scientists to study protein expression, localisation and interactions.  Antibodies remain the most widely used of such reagents and many show excellent performance, although some are poorly characterised or have stability or batch variability issues, supporting the use of alternative binding proteins as complementary reagents for many applications.  Here we report on the use of Affimer proteins as research reagents.  We selected 12 diverse molecular targets for Affimer selection to exemplify their use in common molecular and cellular applications including the (a) selection against various target molecules; (b) modulation of protein function in vitro and in vivo; (c) labelling of tumour antigens in mouse models; and (d) use in affinity fluorescence and super-resolution microscopy.  This work shows that Affimer proteins, as is the case for other alternative binding scaffolds, represent complementary affinity reagents to antibodies for various molecular and cell biology applications. 

学生の頃に研究を始めてから今まで常にいろんな抗体を使って免疫染色をしてきたし、つい最近も数ヶ月かけてようやく出来上がった新しい抗体の使用条件を探っているところなんだけども、実験で使う抗体に代わるものっていつになったら出て来るんかなってずーっと思っていた。このアファーマーっていうのがそれになりうるだろうか。UKのAvactaっていう会社が開発しているようだ。 

"Future challenges are to test the Affimer in even more applications and to encourage its wider use by researchers, alongside other alternative binding proteins, as replacements for some antibodies.  This could ultimately lead to the development of faster and more efficient diagnostic, imaging and therapeutic tests."

new antibody

新しく作った抗体の一つで染色したfollicle cellをコンフォーカルで撮ってみた。左から、wild type、homozygous mutant、heterozygous mutant。核内のシグナルはかなりそれっぽい。細胞質内のpunctate signalはノンスペが結構ありそう。やはりもうちょいプロトコールを調整する必要があるけど、これはいけそうやん。

second half

今日からついに七月か。なんか六月は飛ぶように過ぎ去った感じ。七月は、まずは再来週のミネアポリスがメインイベント。トークの準備をせなあかん。今カレンダーを眺めていて、一件論文のレビューの依頼がきていたのを忘れていた。これも出張の前に片付けとかんとあかんやん。
今日も相変わらず空は曇っているけど気温は結構高い。毎年この時期になると恒例だけど、坂下の田んぼで大きくなったオタマジャクシを捕まえてきた。