２月終わり

今日でもう２月が終わりとは、早いな。。。ついにhectic Marchの始まりか。
そういえば、５月に大阪で開催されるAsia-Pacific Drosophila Research Conferenceの登録締め切りは今日の23:59までやん、ということで、先ほどアブストラクトをすべりこみサブミットしたんだけども、ウェブサイトのNewsっていうところに「The deadline is extended by March 7th.」って書いてある。そうなん？日本の学会ってたいがいアブストのデッドラインを延長するよね。

multiple Drosophila

Genetic and transgenic reagents for Drosophila simulans, D. mauritiana, D. yakuba, D. santomea and D. virilis.  bioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/096644

Species of the Drosophila melanogaster species subgroup, including the species D. simulans, D. mauritiana, D. yakuba, and D. santomea, have long served as model systems for studying evolution. Studies in these species have been limited, however, by a paucity of genetic and transgenic reagents. Here we describe a collection of transgenic and genetic strains generated to facilitate genetic studies within and between these species. We have generated many strains of each species containing mapped piggyBac transposons including an enhanced yellow fluorescent protein gene expressed in the eyes and a phiC31 attP site-specific integration site. We have tested a subset of these lines for integration efficiency and reporter gene expression levels. We have also generated a smaller collection of other lines expressing other genetically encoded fluorescent molecules in the eyes and a number of other transgenic reagents that will be useful for functional studies in these species. In addition, we have mapped the insertion locations of 58 transposable elements in D. virilis that will be useful for genetic mapping studies.

ついにmelanogaster以外のDrosophiaでもgenetic reagentが充実していきそうな感じ。2005年にDartmouthのDr. AEラボで一緒にエボデボやり始めた J がセカンドに入っている。そういや J は、今年の５月からハイデルベルグのEMBLでラボを持つんだそうだ。

２本

年末に投稿した２本の論文に対するレビュワーズコメントが、昨日今日と立て続けに返ってきた。再投稿の締め切りは１本が来週末で、もう１本が再来週。ちょっと今また申請書を執筆している最中なので、これはキツイやん。今年一つ目のビッグウェーブが来た感じ。

Open Now

今日はうちの小さい方の７回目の誕生日。ということで、昨晩一日早めのお祝いをした。

ワインは、ラングドックルシヨン、ミネルヴォアの有機栽培とビオディナミによるものなんだそうな。ブレンドは、Syrah 60%、Mourvèdre 40%。お店で、「このワインは開くまで少し時間がかかりますよ」って教えてもらっていたので、飲む少し前から開けていたのだけど、それでも始めは確かにちょっと堅い印象。樽の木の香りが結構強めだけど、爽やかな酸味と甘いオレンジのような濃い味わい。旨い。

Domaine de Chamans Hegarty Minervois Open Now 2014

Tumor evolution

Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future.  Cell 168: 613–628.

"In a famous thought experiment, evolutionary biologist Stephen Jay Gould asked, if the 'tape of life' could be turned back to the very beginning, would the same outcome prevail?  While re-playing the tape of life remains a hypothetical experiment, the 'tape of cancer' is being played and re-played with increasing regularity and too frequently with lethal results."

weird phenotype

数年前からなんとなくずーっと気になっているphenotypeがある。だいぶ前に撮ったfollicleの写真をまた見直してみて、やっぱりこれは色々とオカシイなということを確認した。これまたあれこれ考えているうちに、これらのphenotypeは最近自分が想像しているコンセプトにアドレスできるモデルの一つになり得るのではないかという気もしてきた。いや、でもやっぱり何が起こっているのかはよく分からんなぁ。この細胞達は周りを気にしてdifferentiationを変更したのか、それとも周りを無視して元々のdifferentiationをそのまま進めてしまったのか、そのへんから。まぁ簡単に考えられる仮説通りだとつまらんけど、やっぱりちょっと実験してみよう。

bud

なんだかすごく眠たいのは低気圧の影響かな。寒いけど、何かの芽が出つつある。

Tamaya CS

Tamaya Reserva Cabernet Sauvignon 2014

先週末、娘の１１歳の誕生日だった。いつの間にこんなに大きくなったのかと思うけど、思い返せばものすごくいろんなことがあった１１年。まぁ、そらそうよね。
ワインは、チリ、リマリバレーのカベルネ100%。甘くて濃くてまろやかで、とても分かりやすい美味さ。やっぱりこういう南米の明るいワインは好きやなぁ。

bet

ついにポリクロ抗体作製を発注した。送られてきた抗原部位予測結果をもとにペプチド配列を検討していたのだけど、ある程度のとこまで決まったらあとはもう運やよなぁ。ということで、３種類のペプチドにbet。予定では３.５ヶ月かかるということなので、完成予定は５月末頃か。まぁ、あとは待つだけやな。

compensatory response

Cancer brings forward oviposition in the fly Drosophila melanogaster.  Ecology and Evolution. 7: 272–276.

Hosts often accelerate their reproductive effort in response to a parasitic infection, especially when their chances of future reproduction decrease with time from the onset of the infection.  Because malignancies usually reduce survival, and hence potentially the fitness, it is expected that hosts with early cancer could have evolved to adjust their life-history traits to maximize their immediate reproductive effort.  Despite the potential importance of these plastic responses, little attention has been devoted to explore how cancers influence animal reproduction.  Here, we use an experimental setup, a colony of genetically modified flies Drosophila melanogaster which develop colorectal cancer in the anterior gut, to show the role of cancer in altering life-history traits.  Specifically, we tested whether females adapt their reproductive strategy in response to harboring cancer.  We found that flies with cancer reached the peak period of oviposition significantly earlier (i.e., 2 days) than healthy ones, while no difference in the length and extent of the fecundity peak was observed between the two groups of flies.  Such compensatory responses to overcome the fitness-limiting effect of cancer could explain the persistence of inherited cancer-causing mutant alleles in the wild.

Apcのmosaic cloneにesg-Gal4でRasV12を発現させることによって、adult flyにcolorectal cancerを誘導し、産卵数の推移をcontrolのnoncancerous flyと比較。その結果、colorectal cancerが誘導されたハエのfecundity peakは、noncancerousなものに比べて少し（２~３日）前倒しになった。fecundity peakにおけるtotal number of eggsとpeakのdurationに関しては、それほど大きな変化は見られなかったと。その、まぁ、それだけなんやけどね。

hypoxia biosensor

Drosophila HIF-1 homologue, Simaのoxygen-dependent degradation domain (ODD) にGFPをくっつけたhypoxia biosensor。

A genetically encoded biosensor for visualizing hypoxia responses in vivo.  Biology Open. doi: 10.1242/bio.018226
Cells experience different oxygen concentrations depending on location, organismal developmental stage, and physiological or pathological conditions.  Responses to reduced oxygen levels (hypoxia) rely on the conserved Hypoxia-Inducible Factor 1 (HIF-1).  Understanding the developmental and tissue-specific responses to changing oxygen levels has been limited by the lack of adequate tools for monitoring HIF-1 in vivo.  To visualise and analyse HIF-1 dynamics in Drosophila, we used a hypoxia biosensor consisting of GFP fused to the oxygen-dependent degradation domain (ODD) of the HIF-1 homologue Sima.  GFP-ODD responds to changing oxygen levels and to genetic manipulations of the hypoxia pathway, reflecting oxygen-dependent regulation of HIF-1 at the single-cell level.  Ratiometric imaging of GFP-ODD and a red-fluorescent reference protein reveals tissue-specific differences in the cellular hypoxic status at ambient normoxia.  Strikingly, cells in the larval brain show distinct hypoxic states that correlate with the distribution and relative densities of respiratory tubes.  We present a set of genetic and image analysis tools that enable new approaches to map hypoxic microenvironments, to probe effects of perturbations on hypoxic signalling, and to identify new regulators of the hypoxia response.

30x9

今日は朝から夕方まで一日中、大学院入試の面接。１人３０分で９人。かなり疲れた。しかしながら明日中に書き上げないといけない書類があったりするので、今晩もう少し頑張らなあかんかな。

six feet under

"Until I'm six feet under

Baby I don't need a bed

Gonna live while I'm alive

I'll sleep when I'm dead"

今朝、目が覚めた時に頭の中で流れ始めたのはなぜか「I'll sleep when I'm dead」。
"six feet under” って、棺桶を埋葬するための穴の深さが６フィートであることから、「埋葬された」「死亡した」という意味なんだそうな。

二月

もう二月。といっても年明けからのこの一ヶ月、あんまり予定は入ってないからゆっくりスタートできるかと思いきや、予想外にすごく大変だった。今月は出張予定もないし、ちょっとゆっくりと研究に集中できればいいけど、そろそろ年末にサブミットした論文のレビューが返って来る頃だろうか。出張といえば、三月後半に予定されている二件の出張のための飛行機を探し中。

third time's the charm

抗体の受託作製を検討中。いろんな会社のウェブサイトを見ていたけど、結局代理店に紹介してもらった一社と連絡を取り始めた。このタンパクの抗体は、まだフロリダにいた時にYF博士のほうでポリクロを二度も作ってもらったのだが、どちらもWesternではなんとかバンドが確認できるものの、残念ながらimmunofluorescenceではほとんど使えないものだった。その後長いこともう一度チャレンジする機会はなかったのだけど、先日大阪でYF博士と話していて、やはりこれは我々がやらなあかんやろ、ということで三度目の正直にかけようと思い立ったのだった。なんか、アミノ酸配列を眺めるのとか久しぶり。メガトゥーラクレヌラータ、キーホールリンペットヘモシアニンとか、なんだか懐かしい響きの言葉を久しぶりに口にしてみたり。

neko

先週の金曜日、K研とM研の合同新春お疲れ会に参加させてもらったのだが、写真はその二次会で行ったお店で飲ませてもらった日本酒達。日本酒のことはよく知らないのだが、なかなかイイお酒ばかりなんだそうな。色々と聞いてから選ばせてもらっただけに、どれも自分好みですごく旨かった。ワインもさらっとスゴイのを出してくれていたし、このお店はまた行きたい。

NAA: non-cell-autonomous autophagy

ノルウェー、オスロのDr. TERのところから、つい最近Natureに報告された論文。最後まで見所が続くエキサイティングなお話だった。Dr. TERとはいつ頃知り合ったんだっけな。ジョンピーがまだ学生の時に少しの間Dr. TERのラボに出向していたことがあって、たぶんどこかの学会でジョンピーに紹介してもらったんだと思うけど。去年のFly MeetingでもWM labの集まりに来ていたDr. TERとテーブルが一緒だったので、その時にも研究の話を色々としたはずなんだけど、そういやあの時この論文に関することは何も言ってなかったな。

Microenvironmental autophagy promotes tumour growth.  Nature 541: 417–420.

As malignant tumours develop, they interact intimately with their microenvironment and can activate autophagy, a catabolic process which provides nutrients during starvation.  How tumours regulate autophagy in vivo and whether autophagy affects tumour growth is controversial.  Here we demonstrate, using a well characterized Drosophila melanogaster malignant tumour model, that non-cell-autonomous autophagy is induced both in the tumour microenvironment and systemically in distant tissues.  Tumour growth can be pharmacologically restrained using autophagy inhibitors, and early-stage tumour growth and invasion are genetically dependent on autophagy within the local tumour microenvironment.  Induction of autophagy is mediated by Drosophila tumour necrosis factor and interleukin-6-like signalling from metabolically stressed tumour cells, whereas tumour growth depends on active amino acid transport.  We show that dormant growth-impaired tumours from autophagy-deficient animals reactivate tumorous growth when transplanted into autophagy-proficient hosts.  We conclude that transformed cells engage surrounding normal cells as active and essential microenvironmental contributors to early tumour growth through nutrient-generating autophagy.

まず、Drosophila eye discsに誘導されたRasV12-expressing scrib mutant clones (RasV12 scrib) が形成するtumorの周りの細胞でautophagy activityが亢進している（Atg8aが蓄積）、という発見からお話が始まる。しかもこのautophagy activityの亢進はeye discの周辺細胞だけではなく、muscle、fat body、midgutといった他臓器でも観察されるのだ。その一方で、RasV12 onlyのbenign tumorの場合、これらのautophagyは観察されない。autophagy flux inhibitorのchloroquineの経口投与によってautophagyを抑制すると、このeye discのtumor growth and invasionが抑えられた。ところが、eye discのtumor tissue内でautophagyを阻害した場合、tumor growthは若干抑えられるだけで、ventral nerve cordへのinvasionは抑えられなかった。これに対し、tumorの周辺細胞、もしくはtumorと周辺細胞の両方でautophagyを阻害すると、tumor growthもinvasionも抑制された。つまり、RasV12 scrib tumorのinitial tumor growth and expansive invasionにはnon-cell-autonomous autophagy (NAA) が必要であるということになる。

これまでの研究によって、RasV12 scrib tumorの growth and invasionには、TNF–JNK–Fos and IL-6–JAK–STAT cytokine signaling pathwaysの関与が分かっている。TNF (Eiger) mutant background、もしくはtumor内でのJNK activityの阻害（bskDN expression or fos mutant）によって、確かにNAAも抑制される。一方、このtumor内でのTNF-JNKの阻害によって、他臓器におけるsystemic autophagyはそれほど抑えられることはなかった（gutでは結構抑えられてるけど）。RasV12 scribのtumor growthにおいて、JNKの下流でHippo signalingが関与しているということも既に報告がある。で、これまたYkiかSdをRasV12 dlg tumorでノックダウンすると、tumor growthとNAAは抑制されることが確認された。

こういうコンテクストでYki、Sd、Fosのターゲットといえば、Impl2、Upd1, 2, and 3である。これらの関係を調べたところ、Impl2はNAA inductionに必要ないが、RasV12とUpd1 or 3のco-overexpressionはNAAを促すことが分かった。つまり、cytokine UpdがNAA inductionをmediateしていると考えられる。そこで、tumor tissue内でJAK-STAT signalingを阻害すると、NAAは確かに抑制されるのだが、周辺細胞でJAK-STAT signalingを阻害しても周辺細胞におけるNAAは抑えられなかった。つまりUpdはtumor cellsにおいてautocrineで働いているということになる。

RasV12 scrib tumorではミトコンドリアがダメージを受けており、reactive oxygen species (ROS) の産生が増加していることも分かった。ND75のノックダウンによるmitochondrial ROSの増加はNAAを促す。RasV12 scrib tumorにおけるJNKもしくはJAK-STAT signalingの阻害は、どちらもROSの蓄積を抑制することができる。つまり、RasV12 scrib tumorにおけるROSと周辺細胞におけるNAAの増加は、どちらもFos-, Yki/Sd- and STAT-mediated mitogenic signalingによるものと言える。また、RasV12 scrib tumorではglucose analogue 2-NBDGの増加が認められ、cationic and neutral amino acid transporterのslimfastをtumor内でノックダウンすると、RasV12 dlgのtumor growthが抑制されることから、これらmetabolic stressを受けているtumorの増殖能の維持はnutrients importに依存しているとも考えられた。

このtumor growthに必要なnutrients importのNAAへの依存性を確かめるために、allograft experimentが行われた。eye discのRasV12 scrib tumorを移植したアダルトの個体ではautophagy activityが上がり、このallograft tumorは、ホストへのautophagy inhibitorの投与、もしくはホストがatg14 mutant backgroundを持っている場合にtumor growthが抑制された。さらに驚くべきことに、autophagy deficient (atg13 mutant) のRasV12 scrib tumorのallograftは、autophagyが正常なcontrol hostのアダルト個体に移植されると、regrowthを始め大きなtumorに成長するのが観察された。つまり、tumor growthはtumor locationやoriginal tumor environmentではなく、ホストのautophagy capacityに依存しているということを示している。
ふーむ、ちょっとややこしいしけど、スゴイことを示しとるな。かなり複雑なgeneticsを使った実験が多いので、フライガイ以外の人にとっては実験系を正確に理解するの難しいんじゃなかろうか。ところで、他臓器でautophagy activityが亢進するsystemicなメカニズムってなんなんやろかね。

PI

Propidium Iodide (PI) というと、自分の中では死細胞の検出に使う蛍光色素というイメージが強かったのだが、FACSでの核染色でも一般的に使用されるんやね。ちなみに PI はDNAの二重らせんにインターカレートされるのだが、RNAとも結合するので正確なDNA測定をする際にはRNase処理が必要となる。
ということで、今日予定していたKのFACS実験を行うために、Kラボにフローサイトメーターを使わせてもらいに行ったのだが、PI染色だとなんやかんやと実験条件が合わないことが発覚して残念ながら今日は断念。今乗っけているRFPマーカーをGFPに変えて、核染色はPIではなくてやはり生細胞用の Vybrant® DyeCycle™ を注文することにする。ちょっと先延ばしになってしまうけど、このFACSは結構重要な実験になるので確実に行きましょうということですわ。

Airway stretch sensor

Piezo2 senses airway stretch and mediates lung inflation-induced apnoea.  Nature 541: 176-181.

Respiratory dysfunction is a notorious cause of perinatal mortality in infants and sleep apnoea in adults, but the mechanisms of respiratory control are not clearly understood.  Mechanical signals transduced by airway-innervating sensory neurons control respiration; however, the physiological significance and molecular mechanisms of these signals remain obscured.  Here we show that global and sensory neuron-specific ablation of the mechanically activated ion channel Piezo2 causes respiratory distress and death in newborn mice.  Optogenetic activation of Piezo2+ vagal sensory neurons causes apnoea in adult mice.  Moreover, induced ablation of Piezo2 in sensory neurons of adult mice causes decreased neuronal responses to lung inflation, an impaired Hering–Breuer mechanoreflex, and increased tidal volume under normal conditions.  These phenotypes are reproduced in mice lacking Piezo2 in the nodose ganglion.  Our data suggest that Piezo2 is an airway stretch sensor and that Piezo2-mediated mechanotransduction within various airway-innervating sensory neurons is critical for establishing efficient respiration at birth and maintaining normal breathing in adults.

「呼吸において肺は膨張と収縮とをくり返す。肺の体積の変化は感覚神経により感知され、この情報は脳幹の呼吸中枢へと送られて呼吸のパターンの制御にかかわる。しかしながら、これまで、肺の体積の変化を検出するセンサーの実体およびその生理的な重要性の詳細については明らかではなかった。今回、筆者らは、マウスを用いて感覚神経に発現するカチオンチャネルPiezo2が肺の膨張を感知する機械的な受容体であることを示した。さらに、Piezo2により検出される肺の機械的な情報は、成体のマウスにおいて肺の過膨張をふせぐために必要であったことにくわえ、出生の直後の仔マウスにおいて正常な呼吸のパターンが確立されるために必要であった。この研究においては，呼吸における機械的な情報の重要性が明確にされた。」

以上、日本語の要約はライフサイエンス新着論文レビューより。

ということで、カチオンチャネルである Piezo2 は、肺の膨張を感知するメカノセンサーとして呼吸パターンの制御に重要な働きを持っているというお話。Piezo2欠損マウスは出生直後に呼吸不全をともない死亡するのだが、肺の発生過程において形態、細胞の分化などに異常は観察されないことから、Piezo2が出生後の呼吸パターンの確立に必要であることが分かった。Wnt1Creを用いて、neural crestに由来する神経節である jugular, trigeminal and dorsal root ganglia でPiezo2をノックダウンすると、Piezo2欠損マウスと同様、出生直後に呼吸不全をともない死亡する。つまり、この呼吸パターンの確立には、感覚神経におけるPiezo2を介したmechanotransductionが必要であると。ちなみにこのWnt1Cre; Piezo2[cKO]でもPiezo2欠損マウスでも、肺のairspacesが小さくなっていることが確認されている。組織像を見ると、細胞が過増殖しているようにも見えるけど、隙間が小さくなってそう見えるだけなのかな。

Mishima→Osaka