BrdUとEdU

皆さんはS phaseの検出にBrdUを使っていますか？まぁ、もちろん細胞を研究している人以外はS phaseの検出なんてしないのは分かっているけど。

先週、以下の論文を読んでいて“EdU”というものを思い出した。というのも最近結構BrdUの代わりにEdUを使っている論文が多いことが気になっていたのだが、実際何が違うのかちゃんと調べたことがなかった。ちなみにこの論文ではどちらも使っているのだが、なぜ実験によって使い分けているのかその説明はない。

Control of Drosophila endocycles by E2F and CRL4[CDT2].  Nature (2011). doi: 10.1038/nature10579. 

簡単にまとめてしまうと、Drosophila salivary glandのendocycleにおいて、gap phaseではE2F1がtranscription factorとしてCycE expressionとS-phase initiationを促し、S phaseではE3 ubiquitin ligase, CRL4[CDT2]がE2F1を分解することによりCycE/Cdk2のactivityは低下する。つまりE2F1がendocycleのmolecular oscillatorとして働いていると。

starved conditionにおいては、salivary glandのendocycle及びcell growthは阻害されるのだが、面白いことにこの時E2F1 proteinのdepletionが起こっており（mRNA levelは変化なし）、またRheb（mTOR activator）のoverexpressionによってこのE2F1 protein levelは回復し、 endocycle及びcell growthの阻害もレスキューされる。つまりE2F1はendocycle progressionとcell growthを結ぶgrowth sensorとしても働いているということである。なるほどなるほど。ちなみにこの論文、Dr. BEとこの仕事かと思ったけどよく見るとDr. CLとかDr. RDとかも共著に入っていて、結構ビッグなコラボですなぁ。

さて、Drosophilaのfollicle cellでBrdU incorporation assayをやると、oogenesis stage 1~6のmitotic  stageと7~10aのendocycle stageではsalivary glandと同じようにBrdU incorporationのoscillating patternが見られる。ところがstage 10bからはこのoscillating patternは消え、全ての細胞の核内に４〜５個のpunctate BrdU incorporation patternが見られるようになる。これはstage 10b以降、follicle cellがいわゆるgene amplification stageに入って、chorion geneのような特定の遺伝子領域だけを増幅するためである。このendocycle/gene amplification (E/A) switchを見るためにはBrdU incorporationが最適な訳だが、どうもfollicleでは時々BrdUの検出が上手くいかないことがあるんですね。stage 10aまでのoscillating patternはたいがい大丈夫なんだけども、gene amplification stageでのpunctate signalがクリアーでないことがある。ちなみに原因は不明なことが多い。それで、じゃあEdUってどうなんだろうということですわ。

以下、invitrogenのClick-iT® EdU Imaging Kitsの説明書より抜粋。

EdU（5-エチニル-2'-デオキシウリジン）はチミジンのヌクレオシド類似体であり、活発なDNA合成の間にDNAに取り込まれます。検出は、クリック反応（アジドとアルキンの間の銅触媒共有結合の反応）を用います。このアプリケーションでは、EdUにアルキンが含まれ、Alexa Fluor®色素にアジドが含まれています。

BrdUプロトコールにおける変性ステップは、核酸の対比染色に影響するような二本鎖DNAの完全性を失わせるだけでなく、細胞の形態および抗原認識部位を破壊することがありました。対照的に、EdU assayキットは使用が容易なだけでなく、細胞周期分析用の色素などのDNAの染色にも完全に適応します。また、このEdU assayキットは、抗体を使った細胞表面および細胞内マーカーの検出と組み合わせてマルチプレックス化することも可能です。最後に、（非特異的結合を示すことのある抗体に依存する）BrdU assayとは違って、Click-iT® EdU assayはバイオオルソゴナルな（生物学的にユニークである）部分を利用するため、低バックグラウンドおよび高検出感度をもたらします。

ということで、BrdUの代わりにEdUを使う上で、メリットはたくさんあるけどデメリットはなさそうかな？

これは試してみよう。これで毎回ちゃあんとfollicleでのoscillating patternとpunctate signalがキレイに検出できるならBrdUはもうやめやな。